实验五抗菌药物敏感性试验与细菌耐药性检测苏州大学附属第二医院谢小芳实验程序一、实验目的二、实验原理三、实验内容四、实验结果五、实验报告一、实验目的1、掌握纸片扩散法（K-B法）原理、操作方法以及结果判读；2、掌握头孢西丁纸片法检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRSA、MRSE及MRCoNS）的方法及结果判读；3、掌握葡萄球菌克林霉素诱导耐药（D试验）的检测方法及结果判读。（一）抗菌药物敏感性试验检测（二）细菌耐药表型检测二、实验原理（一）抗菌药物敏感性试验四种方法1、纸片琼脂扩散法（K-B法）2、稀释法（1）肉汤稀释法（2）琼脂稀释法3、E-test法4、联合药敏试验纸片琼脂扩散法1.基本原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后会不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映检测均对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度(MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。72.试验方法3.结果判读用游标卡尺量取抑菌环直径，根据CLSI标准，报告细菌对该抗菌药物是敏感（S）、中介（I）还是耐药（R）。4.注意事项（1）菌液浊度应配制成0.5麦氏单位；（2）菌液调配好后应在15min内接种完；（3）菌液涂布药敏琼脂后应放置3-5min再贴药敏纸片；（4）贴完纸片后不能再移动纸片；稀释法-最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration,MIC）的测定基本原理在肉汤或琼脂中将抗菌药物进行一系列倍比稀释后，定量接种待检菌，35℃孵育24h后观察。待检菌肉眼未见生长的最低药物浓度，即为该药物对待检菌的最低抑菌浓度。2.试验方法（1）微量液体稀释法（2）琼脂稀释法E-test1.基本原理E-test条为长50mm，宽5mm的商品化无孔试剂载体。一面固定有预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别刻度。将E-test条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈。圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度。2.试验方法菌液和平板接种同K-B法，将E-test条轻放在已涂布菌液的药敏琼脂平板上，刻度朝上，置于35℃孵育24h后观察结果。3.结果判读孵育后围绕着试条可形成一个卵圆形的抑菌圈，抑菌圈与试条的横向相交处的读数刻度即为MIC值。联合药敏试验联合应用抗菌药物，目的在于获得协同作用，提高疗效，减少用药剂量，减轻毒性反应，防止或延缓耐药菌株的产生。（二）细菌耐药表型检测六类检测1、耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测2、葡萄球菌克林霉素诱导耐药的检测（D-test）3、β内酰胺酶的检测4、万古霉素中介（VISA）和耐药金黄色葡萄球菌（VRSA）的检测5、高水平氨基糖苷类耐药肠球菌和万古霉素耐药肠球菌的检测6、青霉素耐药肺炎链球菌（PRSP）的检测MRS是医院感染的主要致病菌之一，其耐药机制由mecA基因介导。MRSA：耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌MRSE：耐甲氧西林的表皮葡萄球菌MRCoNS：耐甲氧西林的凝固酶阴性葡萄球菌耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测1、基本原理：对于耐甲氧西林的葡萄球菌，由于菌体细胞膜上mecA基因介导的青霉素结合蛋白发生改变，导致β内酰胺类抗菌药物不能与之结合或者亲和力降低，表现为该类细菌对所有β内酰胺类抗菌药物耐药2、试验方法MRS菌株的表型检测方法主要有头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林稀释法和苯唑西林盐平板筛选试验，以头孢西丁纸片扩散法最常用。头孢西丁纸片扩散法解释标准1.基本原理：对大环内酯类耐药的葡萄球菌可能有天然或诱导性对克林霉素的耐药，或只对大环内酯类耐药。本试验可以测定诱导性的克林霉素耐药。葡萄球菌克林霉素诱导耐药的检测（D-test）2.试验方法及结果判读三、实验内容1、实验材料（1）药敏纸片：①用于G+c：红霉素、克林霉素、万古霉素、替考拉宁、复方新诺明、新生霉素、头孢西丁②用于G-b：环丙沙星、亚胺培南、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、阿莫西林/棒酸（2）菌株：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌标准菌株；（3）其他：药敏琼脂（上次配制）、无菌棉签、生理盐水、0.5麦氏比浊管...
