非侵入性胎儿非整倍体染色体异常检测技术非侵入性胎儿非整倍体染色体异常检测技术1OUTLINEOUTLINE•非整倍体染色体异常•产前诊断技术•非侵入性检测技术•现状与展望2非整倍体染色体异常非整倍体染色体异常•非整倍体(Aneuploid)，是指个体染色体数目不是成倍增加或者减少，而是成单个或几个的增添或减少。•人类体细胞中常见的非整倍体染色体异常有21-三体、18-三体、13-三体和性染色体异常（超雄或超雌）。3421-三体（唐氏综合征）染色体核型图“唐氏”指挥家舟舟（胡一舟）5母亲年龄(岁)唐氏综合征发生率低于30岁1/1000301/900351/400361/300371/230381/180391/135401/106421/60441/35461/20481/16491/12孕妇年龄与发病风险的关系产前诊断技术产前诊断技术•对发育中的胎儿进行结构或功能异常诊断的科学。分为创伤性和非创伤性检查诊断方法。•筛查：低成本、快速简便、准确率较低、参考结果•诊断：成本较高、周期长、准确率高、临床标准6产前筛查与诊断的比较产前筛查与诊断的比较7方法侵入性孕周特点产前筛查外周血生化筛查NO11-13+65%假阳性率，20~30%漏诊B超检查NO11-13+65-10%假阳性率，技术要求高产前诊断羊水穿刺YES16-21具有一定风险绒毛取样YES10-13+6脐静脉血穿刺YES20-288非侵入性检测技术原理非侵入性检测技术原理•提取母体外周血血浆中的游离DNA片断，构建测序文库；•进行高通量测序，从测序所得的DNA序列中挑选在基因组上有唯一比对位置的片段（uniquereads）；•统计UR在染色体上的分布，根据统计学原理确定胎儿的染色体是否存在非整倍性变化。91011•2008年，斯坦福大学的StephenQuake等科学家研究出利用孕妇外周血中含有的胎儿游离DNA对胎儿非整倍体染色体进行检测的方法，他们对9例21-三体、2例18-三体和1例13-三体进行了检测，检测结果全部符合之前的诊断结论。12•同年，卢煜明领导的科研团队独立研究一种非整倍体染色体异常的非侵入性产前检测方法（算法与斯坦福大学不同）。他们以21-三体综合征（唐氏综合征）为研究对象，从28位孕妇中区分出了14位唐氏儿妈妈。(IF9-10)非侵入性产前检测流程非侵入性产前检测流程13抽取母体外周血血浆DNA提取数据分析出具检测报告文库构建基因测序实验流程与质控实验流程与质控14样品收集样品收集血浆DNA提取血浆DNA提取DNA检测DNA检测文库构建文库构建文库检测文库检测上机测序上机测序样品编号与保存样品编号与保存1.样本采集1.样本采集•孕期为12-24周的单胎孕妇；•静脉采血，EDTA抗凝管采集3-5mL全血；•充分混匀，避免溶血；•4℃保存不超过6hr。15血浆的分离与保存血浆的分离与保存•EDTA抗凝全血，4℃1600g离心10min；•将上清转移至2mL离心管中，4℃16000g离心10min；•将上清分装至1.5mL离心管中，600uL/管；•封口膜密封，防止交叉污染，冰袋运输；•-20℃保存不超过两周，-80℃可保存6个月以上；162.血浆DNA提取、扩增与检测2.血浆DNA提取、扩增与检测•用试剂盒提取血浆中的游离DNA（含有5%-10%胎儿DNA片段）；•用GAPDH看家基因引物扩增（片段大小不超过200bp）•电泳检测扩增产物。17孕妇血浆游离DNAPCR检测孕妇血浆游离DNAPCR检测18•利用GAPDH基因引物对血浆DNA进行扩增，电泳检测，目的片段大小约115bp，四个样本与阳性对照均扩增出目的条带，阴性对照无产物，证明血浆DNA提取成功。血浆DNA浓度检测血浆DNA浓度检测19•Qubit®2.0Fluorometer荧光分析仪•检测DNA浓度范围0.2-100ng/uL•每个样本检测所需时间小于30s3.文库构建与检测3.文库构建与检测•采用DNA小片段建库流程，对文库进行电泳、Agilent2100检测，QPCR定量，验证是否达到上机要求。20末端修复末端修复3’腺苷化3’腺苷化QCQC接头连接接头连接文库纯化文库纯化PCR扩增PCR扩增文库检测文库检测21•电泳检测：主带清晰，片段大小符合预期；•Agilent2100检测：片段与浓度合格，无二聚体或接头污染，无明显杂峰，符合上机要求。4.测序与分析4.测序与分析2224/10/2404:17正常胎儿Chr21:2000正常胎儿21-三体胎儿胎儿Chr21:200母亲Chr21:180021-三体胎儿Chr21:2100胎儿Chr21:300母亲Chr21:1800数据比较：21-三体>正常胎儿1000genome-equival...
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