叶绿体的分离与荧光观察细胞生物学实验实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离，掌握细胞器分离的一般原理和方法。2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。细胞生物学实验实验原理细胞器分离的过程包括三个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离、细胞器的鉴定分析1、在等渗溶液中进行组织匀浆、分离2、叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行3、利用荧光显微镜观察叶绿体的自发荧光和间接荧光（次生/诱发荧光）细胞生物学实验离心分离技术离心是分离细胞组分和生物大分子最常用的分离方法，因为不同的细胞器和分子有不同的体积和密度，可在不同离心力不同介质沉降分离。分离各种细胞组分的方法主要有：差速离心密度梯度离心细胞生物学实验密度梯度离心用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞匀浆液混悬或置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞器分层、分离的方法。这类分离又可分为速率（差速）-区带梯度离心和等密度梯度离心两种。细胞生物学实验速率-区带梯度离心和等密度梯度离心原理：根据分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同沉降速度的不同，通过离心力场的作用，使不同的颗粒在密度梯度层内形成一系列区带，从而达到彼此分离的方法。（分离的颗粒沉降系数相差在20%以内）A、速率-区带梯度离心流程图B、等密度梯度离心流程图原理：根据不同颗粒在密度梯度介质中存在着浮力密度差浮力密度差，在离心力场作用下，颗粒或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力密度的颗粒得到分离的方法。两种密度梯度离心方法的异同特点速率-区带梯度离心等密度离心分离方法的主要依据主要依赖分离的粒子在梯度液中沉降速度的不同沉降速度的不同依赖于样品颗粒的不同密度来进行离心分离的介质密度梯度选择最大密度必须小于样品中粒子的最小密度；梯度平缓覆盖了待分离物质的密度；梯度陡度较高离心介质的主要作用减缓颗粒扩散速度阻止颗粒移动；筛选与分离颗粒分辨率范围沉降系数相差～20%的物质颗粒密度差异大于1%离心后区带形成位置易变(样品易扩散）不变（样品不扩散）影响样品区带形成的主要因素离心时间（过长或过短都不利）颗粒样品密度（平衡后，离心时间和提高转速都无影响）一般操作方法介质梯度应预先形成，离心前将样品小心铺放在密度梯度溶液表面，离心后形成区带。介质梯度不一定需预先制备，离心时把密度均一的介质液和样品混合后装入离心管，通过离心自形成梯度，让颗粒在梯度中进行再分配。常用介质蔗糖、甘油、Ficoll（聚蔗糖）和PercollCsCl、硫酸铯、溴化铯、三碘苯衍生物、Ficoll和Percoll等。细胞生物学实验密度梯度离心的优点①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点：①离心时间较长；②需要特殊的离心介质或制备梯度；③操作严格，不宜掌握。细胞生物学实验荧光荧光显微镜观察荧光现象：某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光,称为自发荧光。如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，称为间接荧光。如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光。细胞生物学实验实验步骤1．洗净菠菜叶，尽可能使它干燥，去叶柄、主脉后，称取2-3g，剪碎。2．加入预冷到近0℃的匀浆介质（0.25mol／L蔗糖，0.05mol／LTris-HCI缓冲液，pH7.4)）10mL，在组织捣碎器上选高速挡捣碎2分钟或冰上用研钵研磨。3．捣碎液用双层纱布过滤到烧杯中。4．将滤液移入2mL离心管，500r／min离心10min，轻轻吸取上清液。5．在1.5mL离心管内依次加入50％蔗糖溶液和15％蔗糖溶液各0.4mL，注意15％蔗糖溶液沿离心管踏缓缓注入，不能搅动50...
