免疫酶斑点试验Dot-ELISA实验目的实验目的2.了解免疫酶斑点技术的用途。1.了解免疫酶斑点技术的基本原理及方法；免疫斑点酶技术的原理免疫斑点酶技术的原理硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜具有很强的静电吸附力,在中性条件下即可有效地吸附蛋白质等生物大分子。将免疫物质吸附于纤维素膜后，就可利用纤维素膜作为固相进行抗原抗体反应。免疫酶斑点技术的特点1.Ag-Ab反应—高特异性2.酶催化作用的高效性—高敏感性3.NC膜的运用—微量抗原的检测1.分组为单位(两桌为一组)实验方法及注意事项2.膜片、抗原、洗涤液、吸水纸在实验台上3.酶标抗体放置在冰箱，使用前取出4.底物临用前配置5.震荡器全班一台,调整好频率后不要乱动方法方法((直接直接法法))1.取硝酸纤维素膜片,用笔做好标记方便加样;2.将稀释的抗原液2μl加于相应格内,室温自然干燥!3.将膜片放入封闭液中震荡封闭15分钟;4.用洗涤液震荡洗3次,每次1分钟,吸干;5.将膜片放入稀释好的酶标抗体液体中，震荡15分钟,吸干;6.将膜片放入洗涤液中,震荡涤洗3次×1分钟,吸干;7.将膜片放入底物液中,震荡15分钟左右观察。明显棕色斑点者为阳性实验结果实验结果免疫斑点试验的影响因素2.酶结合物浓度对试验成功与否至关重要。最适浓度常与包被抗原浓度有关，应根据试验具体条件作方阵滴定来确定。1.包被NC膜的抗原浓度对试验结果影响较大。多以蛋白质含量500～1000μg／ml为宜。浓度过高可出现假阳性，过低则降低试验的敏感性。3.显色时间，一般认为5-10分钟较好。显色时间过长常导致本底着色加深，降低试验的特异性。4.用抗原包被NC检测抗体时，待检样品加样不宜过多。加样过多可使相邻的样品混淆，一般5～10μl即可。免疫酶斑点技术的应用免疫酶斑点技术的应用1.微量抗原的检查;2.抗体分泌细胞、细胞因子产生细胞的筛选;3.自身抗体的检查。
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