系统实验之二系统实验之二TT淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定系统实验之二系统实验之二TT淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定实验流程1W1.双向免疫扩散试验③2.酶联免疫吸附试验(ELISA)④1.双向免疫扩散试验③2.酶联免疫吸附试验(ELISA)④OVA(1mg/ml)+CFAOVA(1mg/ml)+CFA免疫免疫小鼠腹腔内注射小鼠腹腔内注射550000µµllOVA(1mg/ml)+CFAOVA(1mg/ml)+CFA免疫免疫小鼠腹腔内注射小鼠腹腔内注射550000µµllOVA+CFA加强免疫小鼠500µl①OVA+CFA加强免疫小鼠500µl①摘眼球取血无菌取脾和胸腺②摘眼球取血无菌取脾和胸腺②分离血清②分离血清②2W取脾和胸腺②取脾和胸腺②淋巴细胞转化试验②淋巴细胞转化试验②生理盐水（生理盐水（550000µµll))免疫免疫小鼠腹腔内注射小鼠腹腔内注射生理盐水（生理盐水（550000µµll))免疫免疫小鼠腹腔内注射小鼠腹腔内注射生理盐水加强免疫小鼠500µl①生理盐水加强免疫小鼠500µl①2WAfter1W对照组实验组抗体效价增殖功能实验内容实验内容小鼠摘眼球取血、小鼠摘眼球取血、分离血清分离血清淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验教学要求教学要求掌握小鼠血清的分离掌握小鼠血清的分离掌握淋巴细胞转化试验掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作的基本原理及基本操作淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验((Lymphocytetransformationtest)Lymphocytetransformationtest)原理原理检测方法检测方法操作步骤操作步骤应用应用原理原理Lymphocytes(B/T)MitogensSpecificityAgProliferationTransformationLymphoblastNucleicAcid↑Protein↑检测方法检测方法形态学方法形态学方法33HH--TdRTdR掺入法掺入法MTTMTT法法((本次实验采用本次实验采用))形态学方法形态学方法淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的胞的33--44倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。形成空泡。根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及过渡型母细胞和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细成熟的小淋巴细胞胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数，以前三者为转化细胞，每份标本计数200200个细胞，个细胞，按下式计算转化率：按下式计算转化率：100%未转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数转化率33HH--TdRTdR掺入法掺入法G0G0G1G1有丝分裂原特异性抗原SSPr,RNA,DNA前体物质DNA↑↑NewDNANewDNA3H-TdRTdRTdR33HH--TdRTdRcpmcpm值对照管值刺激管cpmcpmConASIMTTMTT法法活活//增殖增殖期的细胞期的细胞线粒体线粒体能量代谢能量代谢琥珀酸脱氢酶琥珀酸脱氢酶MTTMTTMTTMTT掺入掺入还还原原甲甲臜臜颗粒颗粒formazanformazan细胞内细胞内//周围周围溶解溶解测测AA值值值对照管值刺激管AAConASI操作步骤1W1.双向琼脂扩散试验2.酶联免疫吸附试验（ELISA）1.1.双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验2.2.酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISAELISA））OVA免疫/生理盐水OVAOVA免疫免疫//生理盐水生理盐水无菌取脾/胸腺研磨成单细胞悬液(1/2脾/胸腺+2mlIMDM（无FCS)无菌取脾/胸腺研磨成单细胞悬液(1/2脾/胸腺+2mlIMDM（无FCS)摘眼取血摘眼取血摘眼取血获取血清获取血清获取血清细胞计数【?/ml】取20µl细胞+980µl的计数液细胞计数【?/ml】取20µl细胞+980µl的计数液加板(三复孔)(加法见附图)加板(三复孔)(加法见附图)调细胞浓度?/ml×A=1.5×1×107调细胞浓度?/ml×A=1.5×1×10737℃5%CO2培养48小时37℃5%CO2培养48小时培养终止前2小时加入MTT(5mg/ml)10µl/well培养终止前2小时加入MTT(5mg/ml)10µl/well37℃5%CO2继续培养2小时37℃5%CO2继续培养2小时2000rpm5min2000rpm5min小心弃去上清，加入100µl/孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解小心弃去上清，加入100µl/孔DMSO振荡，使颗粒全部溶解酶标仪测吸光度值：...
