DNA 重组技术实验原理、方法和步骤 实验原理 1． DNA 重组技术 重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA 分子水平进行操作的技术。它包括以下几个步骤： 1）重组DNA 分子的构建：即将目的基因（DNA 或 cDNA 片段）与载体DNA重组，应用TA克隆方法,将 PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。该方法利用了PCR 过程中使用的热稳定聚合酶(Taq 酶 )在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR 产物,在DNA 连接酶作用下，目的DNA 和载体DNA 连接形成重组DNA 分子。 2）将重组DNA 分子转化宿主细胞。 3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（ TA 克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA 的细菌。 4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA 分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA 片段的大量拷贝。 图 1 TA 克隆原理示意图 2．质粒DNA 的小量制备 常见的质粒DNA 提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6 碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA 变性，而共价闭环质粒（CC）DNA 仍为自然状态。将pH 调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA 之间交联形成不溶性网状结构。大部分染色体DNA 和蛋白质在去污剂SDS 的作用下形成沉淀，而质粒DNA 仍为可溶状态。通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、 RNA 及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。 3．质粒DNA 的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析 限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切点不固定，Ⅲ型其切割位点在识别位点之外，只有Ⅱ型其特异性切点位置可以控制和预测，可以产生固定的DNA 片段，基因工程中所用的限制酶均为Ⅱ型限制酶。这类酶的特点是具有能够识别双链DNA 分子上的特异性核苷酸序列的能力，能在这个特异性核苷酸序列内切断DNA 双链，形成一定长度和顺序的DNA 片段。选择合适的限制酶对重组的环状质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，用已知相对分子量的线状DNA（ DNA 分子量标志）及未经酶切的重组环状质粒为对照...
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