实验二 不同限制性核酸内切酶对质粒 DNA 的切割 （设计性实验）设计实验目的：培养学生独立完毕实验设计、实验操作和撰写小论文的能力。设计实验规定：选用 1 或 2 种内切酶，将所提供的质粒 DNA 切割为最少 3-4个以上的片段。设计实验过程：学生根据实验规定，运用学过的知识，先设计实验方案，提交老师批阅承认；再独立进行实验准备和实验；实验结束，撰写设计性实验报告，即小论文 1 篇。小论文规定：字数不少于 3000，涉及论文题目、作者、摘要、核心词、引言、材料与办法、成果与分析、结论或讨论、参考文献等。设计实验涉及知识点：1）质粒的限制性内切酶图谱；2）质粒酶切鉴定；3）DNA 片段的琼脂糖凝胶电泳。设计实验规定学生独立撰写小论文。Digestion of plasmid DNA with different restriction endonuclease不同限制性核酸内切酶对质粒 DNA 的切割一、 原理 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的 DNA 序列之内或其附近的特异位点上,并切割双链 DNA。它可分为三类:Ⅰ 类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰(甲基化)作用且依赖于 ATP 的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的 DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割 DNA 分子, 然后从底物上解离。Ⅱ类由两种酶构成: 一种为限制性内切核酸酶(限制酶),它切割某一特异的核苷酸序列; 另一种为独立的甲基化酶, 它修饰同一识别序列。Ⅱ类中的限制性内切酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。绝大多数Ⅱ类限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ 识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3'),有少数酶识别更长的序列或简并序列。Ⅱ类酶切割位点在识别序列中,有的在对称轴处切割,产生平末端的 DNA 片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位点在对称轴一侧,产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未端, 如 EcoRⅠ 切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5'…G↓AATTC …3' →5'… G AATTC…3' 3'…CTTAA↑G …5' →3'… CTTAA G…5' 大部分限制性内切酶不受 RNA 或单链 DNA 的影响。当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时, 会影响其进一步使用,因此在吸取限制性内切酶时, 每次都要用新的吸管头。如果采用两种限制性内切酶, 必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液,则可同时水解。若需要不同的盐浓度, 则低盐浓...
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