PCR引物设计的黄金法则1. 引物最好在模板 cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment ），各基因相同的序列就是该基因的保守区。2. 引物长度一般在 15~30碱基之间。引物长度（ primer length ）常用的是 18-27 bp，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应。3. 引物 GC含量在 40%~60%之间， Tm值最好接近 72℃。GC含量（ composition ）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的 GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（melting temperature ）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值 5~10℃。若按公式 Tm= 4（G+C）+2（A+T）估计引物的 Tm值，则有效引物的Tm为 55~80℃，其 Tm值最好接近 72℃以使复性条件最佳。4. 引物 3′ 端要避开密码子的第3 位。如扩增编码区域，引物3′ 端不要终止于密码子的第3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。5. 引物 3′ 端不能选择 A，最好选择 T。引物 3′ 端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为 A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T 之间，所以 3′ 端最好选择 T。6. 碱基要随机分布。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（False priming ）。降低引物与模板相似性的一种方法是， 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′ 端不应超过 3 个连续的 G或 C，因这样会使引物在 GC富集序列区错误引发。7. 引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin ）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4 个碱基的互补。两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′ 端的互补重叠以防止引物二聚体（ Dimer 与 Cross dimer ）的形成。引物之间不能有连续 4 个碱基的互补。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于 4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物...
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