下载后可任意编辑T-A 克隆操作规程一、实验用品的查看和准备PCR 模板：待测混合菌引物：sgR、sgF SP6、T7大肠杆菌 JM109 高敏感受态、新奇 LB 或 SOB 培育基酶和生化试剂：Taq DNA 聚合酶、 氨卞抗生素（Amp）、X-Gal、IPTG、 DNA Maker DL2000 、DNA Maker λ Hind Ⅲ、 胶回收试剂盒、 T4 DNA 连接酶、T-vector二、实验操作1、PCR 扩增目的 DNA 片段按《单菌 16S 扩增操作规程》进行混合菌 16S 的扩增。2、PCR 产物回收按《切胶操作规程》进行大小为 1.5KB 的目的 DNA 片段的切取和回收，电泳验证。3、连接短暂离心载体和对比插入 DNA ，使沉于管底。取新的经灭菌处理的 0.5ml eppendorf 管，按以下连接体系加入各种物质，胶回收产物量视电泳结果和吸光度而定，用无菌水补足体积到 10 μL。用枪混匀后在微量离心机上将液体全部甩到管底，于 14-16℃保温 8-24 小时或4℃过夜。 16S 胶回收产物X uL2X Rapid ligation buffer5.0 µLT-Vector1.0 µLT4 DNA ligase1.0 µLddH2O(3-X) uL4、转化1)、取足够量的冰制成冰盒，从-80℃冰箱拿出大肠杆菌 JM109 高效感受态置于冰盒中 5 min 使其融化，轻轻摇晃混匀。3uL 连接产物2）、将 1uL pET-28a （阳性对比） 分别加到对应的感受态细胞中，轻轻摇匀。 什么都不加 （阴性对比）3）、置于冰上放置 20 min-30 min。4）、42℃（精确）热激 90 S，不要摇动。5）、立即置于冰上 2 min。下载后可任意编辑6）、加入 950 uL SOB 或 LB 培育基（无抗生素），阳性对比加 900 uL。7）、37℃ 150rpm 左右摇床培育 1-1.5h。在这期间取出 SOB 或 LB 平板，其中一个 Kan 抗性，其余为 Amp 抗性。在酒精灯附近取 40 uL 20mg/mL X-gal 和 7 uL 200 mg/mL IPTG用玻璃棒均匀的涂布在平板上。 8）、8000 rpm 离心 2 min，倒去大部分上清，剩余约 300 uL，洗打混匀后取 100 uL 用玻璃棒均匀的涂布在平板上。9）、37℃倒置培育过夜（16 h-24 h）。10）、每个平板上应出现约 100 个菌落，置于 4℃最少 2 h 以使蓝斑颜色加深。白斑通常含插入片段，有的蓝斑也含。5、转板：按《挑菌转板操作规程》将约 96 个白斑转到一新的平板上。6、菌落 PCR 验证：除引物为SP6 、T7，其他一切按《单菌 16S 扩增操作规程》操作。7、质粒提取验证：按《SDS 碱裂解法抽提质粒》抽提质粒，电泳检测大小。最...
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